复旦团队开发术中三维病理平台，无标记成像30分钟出结果

胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤，通常没有清晰规则的边界。肿瘤细胞会弥散地浸润周围脑组织，并且在不同位置和深度分布不均。因此，如果切片没有覆盖到肿瘤细胞聚集的区域，检查结果就可能无法完整反映整块组织的真实情况。 这项技术不需要先把组织切成大量薄片，也不需要进行传统染色。研究人员先让脑组织在几分钟内变得透明，再用受激拉曼散射显微镜逐层扫描，最后通过人工智能处理图像，生成病理医生熟悉的三维虚拟染色结果。对于约 1 立方毫米的胶质瘤边缘样本，整套处理、成像和分析流程可在约 30 分钟内完成。 “我们最初想解决的，主要是术中病理场景下的信息缺失问题。”施立雪告诉 DeepTech，“我们希望在术中尽可能呈现整个组织块的三维信息，减少二维切片采样不足带来的误差。”施立雪现为复旦大学生物医学研究院准聘副教授，主要从事下一代生物成像技术及其生物医学应用研究，包括非线性拉曼成像、红外光谱成像，以及代谢成像、新型病理检测方法、界面水成像等。 当时，她和团队开发了一种多色拉曼成像技术，通过将拉曼染料与组织透明化结合，可以在毫米级厚度的组织中进行多色免疫标记成像。通过标记不同的蛋白，研究人员可以观察不同类型细胞在组织原位的空间分布。 这项工作让她产生了对三维病理的初步设想。不过，当时的研究思路更接近分子病理：先用染料标记特定分子，再观察它们在组织中的三维位置。 回国后，随着她对人工智能、虚拟染色和图像处理的了解加深，加上季敏标团队此前在受激拉曼组织学算法方面的积累，研究方向开始发生变化。团队逐渐从依赖分子标记的三维成像，转向无标记的三维形态病理。 这一转向既来自技术积累，也来自术中病理的现实需求：要让三维病理真正进入手术室，首先必须把处理时间缩短到手术能够等待的范围。 传统病理的金标准是石蜡切片。组织需要经过固定、包埋、切片、脱蜡和染色等多个步骤，图像质量较高，但通常无法在手术过程中完成。术中一般使用速度更快的冰冻切片，但冰冻可能造成组织变形，染色效果也不如石蜡切片。受时间限制，医生通常只能检查一两张切片，容易遗漏组织中分布不均的肿瘤细胞。 三维病理可以减少这种采样不足，但以往的方法同样很难进入手术室。它们通常需要先让组织透明，再等待荧光染料进入组织，仅样品处理就可能花费两天左右。 为了减少二维切片采样不足带来的误差，团队希望在术中尽可能呈现整个组织块的三维信息。但要让三维病理真正进入手术室，首先需要把处理时间缩短到医生可以等待的范围。 团队因此选择了无标记成像路线，用受激拉曼散射显微镜直接读取组织自身的化学信息。不同化学键具有不同的振动特点，这项技术可以识别组织中的脂质、蛋白质等成分。由于细胞核、细胞质和细胞膜的组成存在差异，研究人员能够根据这些信号分辨细胞和组织结构。 “很难简单地说哪一种方式更好。”施立雪表示，H&E 染色仍然是病理诊断的金标准。ULTRA 并不是要证明无标记成像优于传统病理，而是希望在对时效性要求极高的术中条件下，提供尽可能接近传统病理的图像质量和更多的组织信息。 脑组织含有大量脂质，光线进入后容易发生散射，深层结构也因此难以看清。为进行三维成像，研究人员需要先让组织变得透明，同时尽量保留其中可供拉曼成像识别的化学信息。 施立雪介绍，团队从已有研究中获得启发，通过改变细胞膜状态，加快透明化试剂在组织中的渗透。经过筛选，他们最终形成了一套由尿素、氘代 DMSO（二甲基亚砜）和环糊精组成的透明化方案，并通过加热缩短处理时间。其中，环糊精可以去除部分胆固醇，提高组织通透性；使用氘代 DMSO，则可以减少普通 DMSO 产生的拉曼信号干扰。 组织透明后，受激拉曼显微镜会逐层采集图像，形成三维数据。人工智能随后对原始图像进行降噪、信息预测和虚拟染色，将其转换成接近传统 H&E 染色的图像，供病理医生观察。 而且，ULTRA 基本上是一种无损的技术路线。完成成像后，同一份样本仍可继续用于常规病理、免疫组化和 RNA 分析，为它与现有病理流程结合留下了空间。 为了将显微镜采集的原始拉曼信号，转化为病理医生熟悉且能够直接观察的切片图像，ULTRA 使用三个连续的人工智能模型处理数据。 第一个模型负责去除深层图像中的噪声；第二个模型根据实际采集的脂质信号预测蛋白质信息，从而减少一个成像通道，缩短扫描时间；第三个模型进行虚拟染色，把拉曼图像转换成接近传统 H&E 染色的图像。 病理医生由此可以按照熟悉的方式，观察细胞核大小、细胞密度、组织结构和血管变化等特征，同时在不同深度之间移动，查看完整的三维组织。 施立雪表示，团队在算法训练和验证中重点关注了这一风险。其中，图像修复模型主要学习噪声随成像深度发生的变化，而不是学习某种肿瘤应该长什么样，以降低生成虚假病理结构的可能。季敏标团队此前积累的大量脑组织虚拟染色数据，也为模型训练和验证提供了基础。 为了验证这套方法能否用于真实的脑肿瘤样本，研究人员先在人脑和小鼠脑组织中测试了成像效果，并将虚拟染色结果与传统病理进行比较。在目前的测试范围内，ULTRA 得到的细胞密度等信息与传统 H&E 病理较为一致。 在此基础上，团队进一步分析了 17 名脑肿瘤患者的手术样本。患者年龄在 35 岁至 75 岁之间，包括 4 例星形细胞瘤、5 例少突胶质细胞瘤、5 例胶质母细胞瘤，以及 1 例儿童弥漫性半球胶质瘤和 2 例低级别胶质瘤。 在这些样本中，ULTRA 呈现出了不同类型胶质瘤的典型病理特征。例如，少突胶质细胞瘤中较为均匀的圆形细胞核，星形细胞瘤中的细胞核异型，以及胶质母细胞瘤中的微血管增生和坏死。由于获得的是完整的三维数据，研究人员还可以进一步分析细胞核的体积、密度及其在组织中的空间分布。 胶质瘤具有弥散生长的特点，但真正困难的是观察到肿瘤细胞究竟扩散到了哪里，以及如何更准确地判断肿瘤与周围脑组织之间的过渡区域。 在一块约 1 立方毫米的胶质母细胞瘤边缘样本中，ULTRA 呈现了从致密肿瘤区、稀疏浸润区到相对正常脑组织的过渡。结果显示，胶质瘤边界并不是一个平整、清晰的切面，而是一个随组织深度不断起伏和变化的立体区域。 这种空间差异也说明了二维切片可能存在的局限。当两名病理医生分别查看三维数据中的单层图像时，都漏掉了部分只在其他深度显现的肿瘤区域，漏检比例分别为 20% 和 23%。这并不意味着医生没有识别出眼前的病理特征，而是所观察的平面可能恰好没有覆盖到肿瘤。 研究人员还分析了临床上较难判断的区域。在两份取自 MRI 水肿带的样本中，ULTRA 观察到了明显的肿瘤浸润；另外两份在术中导航上看似正常、神经电生理监测也呈阴性的样本，同样显示出肿瘤累及。这些结果进一步表明，肿瘤细胞在组织中的分布可能具有明显的深度差异，而三维病理能够提供二维切片难以呈现的空间信息。 未来，施立雪希望 ULTRA 能作为一种补充工具，在冰冻切片结果不够明确，或者医生希望了解肿瘤在不同深度的分布时，提供额外的空间信息。 目前，ULTRA 主要呈现细胞和组织的形态。未来，团队希望进一步利用图像算法推断蛋白质表达或转录组特征，将其从无标记三维形态病理拓展到无标记三维分子病理。“具体来说，我们希望在三维组织中，不仅观察细胞和组织的形态，还能够通过算法推断某些分子标志物的表达情况，从而在无标记条件下获得三维分子病理信息。”